NCI-H520（人肺鳞癌细胞）培养攻略秘籍
NCI-H520（人肺鳞癌细胞）
培养攻略秘籍!
1982年，A.F. Gazdar与他的同事从一名肺鳞状细胞carcimoma患者的肺标本中提取出NCI-H520细胞系。NCI-H520细胞呈上皮细胞样，贴壁呈岛状生长。
本期的逍鹏讲堂就培养NCI-H520应注意的细节，逐一为大家“避坑”，Let’s start!
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细胞基本信息
● 名称：NCI-H520（人肺鳞癌细胞）
● 种属：人
● 生长特性：贴壁细胞
● 细胞形态：上皮细胞样，呈岛状（见图1）
● 推荐传代比例：1:2-1:4
● 推荐换液频率：2-3次/周
图1 NCI-H520（图片来源于网络）
01
正确传代步骤(以T25培养瓶为例)
● 第一步：吸液
从培养瓶中吸出原培养液，尽量吸取干净，减少后续对消化的影响。
● 第二步：润洗
加入2-3mL常温PBS（VivaCell，C3580），轻轻晃动培养瓶，润洗瓶底的细胞层10-20秒，吸出PBS，此步骤可将残留的培养液清洗干净。
● 第三步：加酶
加入1mL胰酶溶液（VivaCell，C3530），使之可以均匀浸润所有细胞。（根据具体实验情况，选择加入胰酶含量）
● 第四步：消化
将培养瓶放入CO2培养箱消化，消化时间3-5min，在显微镜下观察到细胞间隙变大，但未完全脱落。此时加入2-3mL含有血清的培养基终止胰酶消化（利用了竞争抑制的原理），轻柔吹打细胞使之呈单颗悬浮状态，避免产生过多气泡造成细胞破碎。（根据具体实验情况，调整消化时间）
● 第五步：离心
使用移液枪吹打并混匀细胞，1000rpm离心 4-5min，离心完吸出上清并丢弃。（根据具体实验情况，调整离心的转速和时间）
● 第六步：加培养基传代
离心管中加入新鲜培养基，移液枪吹打并混匀细胞，注意动作轻柔，按照推荐的比例接种到新培养瓶，补足新鲜的培养基。接种完成后，放回CO2培养箱静置培养，后续观察细胞生长情况。
● 第七步：观察细胞生长
在显微镜下观察细胞的生长状态，正常人肺鳞癌细胞呈上皮样细胞样，岛状贴壁生长。
02
冻存方法
● 消化并离心获得细胞沉淀后，加无血清冻存液（VivaCell，C3522或C3523）并重悬细胞；
● 将细胞悬液尽快移入已经做好标记的冻存管，建议每管无血清冻存液使用量为1mL或1.5mL；
● 采用逐步降温方法，可将加入细胞的冻存管放在泡沫盒中4℃静置30min，再-20℃静置1h，后转入-80℃过夜，第二天转入液氮保存；或将冻存管转入程序冻存盒，放入-80℃冰箱过夜，第二天转入液氮保存。不建议长期保存在-80℃的冰箱中，易造成细胞复苏率的降低。
03
注意事项
● 吹打轻柔
在吹打过程中，将细胞吹打成单个悬浮细胞状态，注意动作的轻柔，避免产生过多的气泡，以免造成损伤细胞。如果吹散不开，导致细胞成团，也会影响细胞的生长。
● 细胞培养出现黑点
在显微镜下会观察到细胞内有小黑点，这并不是污染，可能是细胞分泌泡、细胞器或者是细胞膜上表面物质折光造成的。细胞外也会有黑色颗粒，大部分是细胞碎片，换液可以改善。以上是培养人肺鳞癌细胞中常见现象，不会影响细胞增殖和实验的开展。
● 消化时间
掌握正确的消化时间关乎实验的成败，消化时间过长，造成细胞损伤甚至死亡，消化时间过短，细胞无法从培养瓶（皿）上脱落下来，需严格遵循消化时间。使用（VivaCell，C3530）胰酶消化液，可以消化贴壁细胞。消化时间3分钟左右，以细胞间隙变大，但未完全脱落作为消化终止的标准。当使用其他品牌的胰酶产品，需要摸索消化的时间，因为不同品牌胰酶产品的消化能力是存在较大差异的。
● 生长偏慢
当细胞生长缓慢时，排除污染的情况，可能是血清的营养成分不够，可以适当提高5%-10%的血清的比例（血清的总比例不要超过20%），当细胞状态良好时，可以将血清的比例回复到正常的水平。（推荐使用VivaCell，C04001胎牛血清）
VivaCell提供的产品种类多样，批次稳定，上文中所提及到的产品如下，用户可以根据自己的需要进行选择。
产品推荐
胎牛血清（VivaCell，C04001）
胰酶产品（VivaCell，C3530）
无血清冻存液（VivaCell，C3522或C3523）
PBS（VivaCell，C3580）
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