3D培养 | 三维结构下的细胞与类器官
三维细胞培养(Three-dimensional cell culture,3D细胞培养)这个名词已然成为生物科学领域的热点。近几年围绕“3D细胞培养”公开发表的文章或评论数量上升迅猛,3D细胞培养衍生的类器官技术同样成为研究学者的利器。2017年,《自然》杂志的子刊《Nature Methods》评价类器官为生命领域的年度技术;2019年,Organoids登上了《科学》杂志的封面,且为类器官特刊。悄然之间,类器官技术出现在各大顶级期刊杂志。2021年,“十四五”重点研发计划更是把相关肿瘤类器官的研究列为首批重点专项任务。
图1 3D/2D细胞培养发表文献数量比较(左图);3D细胞培养的市场规模分析(右图)
#3D细胞培养的概念
3D细胞培养是指将动物细胞与具有三维结构的支架材料共同培养,使细胞能够在三维立体的空间生长、增殖和迁移,构成三维的细胞-细胞或细胞-载体复合物,从而更好地模拟细胞在体内的生长环境。
目前主要分为有支架和无支架的三维培养技术,其中依附支架的材料主要包括胶原和水凝胶等,价格低廉、操作简单;不依附支架的主要是通过物理方法进行培养,主要包括微载体、磁悬浮、悬滴板等,这类操作复杂、成本投入较大。
图2 2D培养的人结肠癌细胞(HCT116);利用VitroGel水凝胶3D培养的HCT116
#3D细胞培养的最新动态
【Stem Cell Res Ther】利用VitroGel水凝胶包裹光活化的脂肪来源的干细胞原位移植改善肥胖小鼠的糖代谢。
【Cell Mol Biol Lett】利用VitroGel水凝胶来研究经MSC-CXCL12刺激后的巨噬细胞与肿瘤细胞的共培养。
【Cell Stem Cell】利用Matrigel构建人肺泡干细胞培养模型揭示对SARS-CoV-2的感染反应。
【Cell】结合先进的3D细胞培养和3D生物打印技术构建体外人体的关节模型。
【Nat Commun】自动化微流体平台助力肿瘤类器官的药物筛选研究。
#3D细胞培养与类器官的联系
类器官(Organoids)是一种在体外环境下培养而成的具备三维结构的微器官,具有类似于真实器官的复杂结构,并可以部分模拟来源(干细胞、肿瘤组织、病人来源等)组织或器官的生理功能。截至目前已有10多种不同组织、疾病模型及模拟发育的类器官问世。类器官作为一项重大的技术突破,已被公认为生物科学领域研究的重要工具,并具有重要的临床应用价值。
从类器官的定义和来源来看,是将多能干细胞或患者来源的肿瘤组织等进行3D细胞培养,从而形成相应器官的自组织,并具有自我更新和自我组织的能力,故又称“平皿里的器官”。综上,类器官属于3D细胞培养物,包含器官特异性细胞类型,可以表现出器官的空间组织和复制器官的某些功能。类器官重现了一个生理上高度相关的系统,在三维体系下可以研究复杂的问题。例如,疾病发作、组织再生和器官之间的相互作用。
图3 利用VitroGel ORGANOID水凝胶进行小鼠肠类器官的培养
#如何开展类器官研究
01 样本来源
稳定的细胞系:诱导多能干细胞,胚胎干细胞,成体干细胞,永生化细胞系,原代细胞系等;
组织类:正常组织,肿瘤组织以及人源异种移植模型等。
02 培养体系
基础培养基:DMEM/F12(适合克隆培养)等;
常用的生长因子和小分子。
Wnt信号通路激活剂:R-Spondin 1,Wnt-3a;
酪氨酸受体激酶的配体,刺激上皮细胞增殖:EGF;
TGF-β信号通路抑制剂,抑制上皮细胞分化:Noggin;
ROCK抑制剂,保持干细胞多能性:Y-27632。
03 3D培养的细胞外基质
VitroGel水凝胶:无动物源成分的功能性水凝胶,室温下进行,操作简单;
Matrigel/BME等:小鼠肉瘤提取物,成分复杂,操作繁琐。
04 类器官培养与应用的简易流程图
图4 类器官培养流程图
#类器官培养方法的比较
类器官的来源广泛,样本材料经过不同方法处理后需要在体外进行培养,构建3D培养模型。不同细胞外基质可采用的培养方法也会存在差异,但都可以为类器官体外培养提供生长的微环境。其中VitroGel水凝胶为无动物源成分的功能性水凝胶,室温下与细胞培养基或含离子成分的溶液混合即可成胶,类器官培养方法多样;而目前使用较多的Matrigel或其它含动物源成分的基质胶,所有操作或者材料需要在冰上进行,且主要以圆顶(Dome)形式进行类器官培养。现对两类细胞外基质用于类器官培养的操作方法进行比较:
2D包被培养
主要将细胞外基质先铺板粘附凝固后再将细胞添加在表面,细胞会通过基质表面的孔径渗入到内部,添加覆盖培养基后培养形成类器官。
3D包裹培养
主要将细胞外基质与细胞悬液按一定比例混合,再转移到培养皿中,待形成软凝胶或固化后再添加覆盖培养基进行培养形成类器官。
液滴式培养
主要利用VitroGel水凝胶的特性进行特有的类器官培养。水凝胶与细胞悬液混合后形成软凝胶后,仍具有流变性和一定的剪切力,允许以液滴的形式滴加在培养基中培养形成类器官。
目前,类器官培养技术正处于技术爆发和科研成果井喷的阶段,行业发展具有很大的前景,但挑战也是并存的。例如,大多数类器官本身不具备血管化的结构;如何在体外模拟肿瘤类器官与免疫细胞相互作用关系;类器官的重复性和一致性;以及类器官下游应用的准确性等。总之,新的技术不断涌现,助力再生医学与精准医疗领域的研究更上一层楼。
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参考文献
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Schuster B, Junkin M, Kashaf SS, et al. Automated microfluidic platform for dynamic and combinatorial drug screening of tumor organoids. Nat Commun. 2020, 11(1): 5271.
Jorgensen C, Simon M. In Vitro Human Joint Models Combining Advanced 3D Cell Culture and Cutting-Edge 3D Bioprinting Technologies. Cells. 2021, 10(3): 596.
Youk J, Kim T, Evans KV, et al. Three-Dimensional Human Alveolar Stem Cell Culture Models Reveal Infection Response to SARS-CoV-2. Cell Stem Cell. 2020, ;27(6): 905-919.e10.
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