外泌体量产,你真的做对了吗?
细胞外囊泡(EVs)作为细胞间通信交流的重要介质,参与多种疾病的发生与发展。近年来,干细胞来源的EVs在多种器官及组织损伤中有巨大潜力,展现出良好的临床转化应用前景。然而,目前我们面临的最大挑战是外泌体产量低,缺乏有效的规模化干细胞EVs生产平台,这限制了干细胞EVs的临床转化。
美国南加州大学附属洛杉矶儿童医院的科研团队,建立了一种3D生物反应器高效生产羊膜干细胞EVs的方法,并且发现生产的EVs比2D培养皿生产的EVs具有更高的生物活性,产量可支持CGMP兼容系统的临床应用。
该团队利用两种方法培养人羊水干细胞(Amniotic Fluid Stem Cell, AFSC),并收集EVs:
3D中空纤维培养系统收集的EVs(3D EVs)
2D培养皿培养羊水干细胞收集的EVs(2D EVs)
将收集的EVs进行产量、效能特性及治疗潜力比较。
方法
在2D培养皿(145cm2)上接种1×106 hAFSC细胞,FiberCell小型培养筒(#C2025D, 20 kD MWCO, 450 cm2)先用fibronectin包被,再接种1.6×107 hAFSC,用含20%胚胎干细胞专用胎牛血清的羊水培养基培养。培养皿饥饿培养24小时后收集EVs,第5天将HFBR纤维管外空间血清取出,仅在纤维管内空间中循环,测试收集频率的影响(1小时,24小时)。通过颗粒浓度分析、效能测定、鉴定(Exoview分析)和治疗效果(慢性肾脏疾病Alport综合征小鼠模型的体内实验)比较2D EVs和3D EVs。
结果
01 收获EVs产量及粒径浓度分析
2D收获EVs总量为2.8x1010,体积为20ml,浓度为1.4x109EV/ml。3D HFBR收获的EVs浓度约2.8×1010EV/ml(4*24小时收获),及4.4x1010EV/ml(2天内每小时收获),每次收获体积为2ml。在每小时收获的2天内,共收集到50ml,2.2x1012个EVs。
HFBR每天生产的EVs相当于25个培养皿。
2D和3D EVs粒径分布相似(~130nm)。不同收获间隔的EVs浓度差异不大,可能是由于上清液中的游离EVs导致大量EVs被重新摄取或分泌受到抑制。
图1: NTA分析EVs
02 ExoView 检测四跨膜蛋白的表达
通过ExoView检测发现,3D EVs中CD63的表达水平高于2D EVs,而其他四跨膜蛋白呈现出轻微的修饰,这可能是由于3D培养条件,无细胞传代,或血清蛋白对中空纤维生物反应器中细胞的影响。
图2: ExoView 检测四跨膜蛋白的表达
03 EVs 效能测定
用免疫共沉淀法检测EVs与VEGF的结合能力(一种体外建立的效能测定方法),与VRGFR1共同免疫沉淀并用2D EVs和3D EVs处理24小时后VEGF的代表性免疫印迹,并与未处理对照组相比,来观察EVs捕获VEGF的能力。3D EVs可以像2D EVs一样有效地捕获VEGF。
图3: EVs 效能测定
04 EVs改善Alport综合征小鼠的蛋白尿
当将3D和2D EVs注射到Alport综合征小鼠中时,蛋白尿可得到类似的改善,而注射3D EVs的蛋白尿改善效果更显著。
图4:用3D中空纤维(n=6,绿色)和2D培养皿(n=10,红色)收获的的AFSC hEVs注射Alport小鼠,对照组(n=14,黑色)
结论
3D EVs和2D EVs具有类似的性质,包括大小,效能,以及在慢性肾损伤模型的体内疾病缓解活性。除了四跨膜蛋白的表达差异,两种EVs均显示出体外效价和体内生物活性。
这是另一个栗子
来自东南大学中大医院科研团队,今年发表在Stem Cell Research & Therapy上的文章,也有同样的研究发现。该团队将2x108脐带分离的MSC,分别接种于2D培养瓶(T225)以及中型中空纤维培养筒(FiberCell,#C2011, 20 kD MWCO, 3000cm2),并收获EVs,比较了不同EVs的产量,特征以及治疗效果。3D EVs比2D EVs的产量增加19.4倍,3D EVs的收获浓度是2D EVs浓度的15.5倍。在体内实验中,3D EVs可显著改善顺铂诱导的急性肾损伤,且比2D EVs有更强的肾脏保护功效。
MSC在3D中空纤维生物反应器中共运行了55天,在第55天的时候,抽取部分细胞做活性检测,细胞活率高达95%,并且仍高表达(>97%)MSC表面标记物。
图5. 取出部分3D中空纤维系统中的MSC,2D平盘扩增后流式检测。
目前干细胞来源的EVs在脑、中枢神经系统、骨与软骨、心血管、肝脏、肾脏及皮肤等多种组织和器官损伤中均显示良好疗效,已经有干细胞衍生外泌体的临床试验正在进行中。国内外也有多个团队将干细胞来源EVs用来治疗COVID-19新冠肺炎的研究。
HFBR的干细胞培养条件仍需要优化,大型培养筒的表面积可达1.2m2,该封闭的CGMP兼容的系统,可以提供相当于现有3D系统30倍的放大倍数。HFBR可生产足够数量的EVs,以支持临床前和临床应用。
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