不同试剂盒提取外泌体的效果比较
来自葡萄牙阿威罗大学的Tânia等人以血清、血浆和脑脊髓液为研究对象,比较了三种商品化试剂盒提取外泌体的效果(其中两种为沉降法/precipitation,另一种为尺寸排除色谱法/size exclusive column,SEC)。三种商品化试剂盒均成功提取出了外泌体;在回收率和纯度上,基于SEC的Exo-spin(品牌:Cell Guidance Systems)表现最佳。
目前外泌体的研究如火如荼,提取方法也多种多样,但对于哪种提取方法最有效仍没有形成一致的意见。差速离心法(超速离心)被誉为外泌体提取“金方法”,利用该法可提取出纯度相对较高的外泌体,但样本要求量大,费时费力,收率低,且对仪器设备和操作人员的水平也有一定要求;所以它的可重复性低,不同的实验室提取的效果参差不齐。
另外如血浆类等粘稠性的样本,还需提高超速离心速度,延长超速离心时间,甚至多次重复才能获得高质量的外泌体。
因此,其他的方法也一直被需求。
来自葡萄牙阿威罗大学的Tânia等以血清、血浆和脑脊髓液为研究对象,选择三种商品化试剂盒,比较了两种沉降法(precipitation:TEI和ExoQ,此为简写,全称见下方注释)和尺寸排除色谱法(size exclusive column:ExoS)提取外泌体的效果。该团队用纳米颗粒追踪分析法(Nanoparticle Tracking Analysis),电泳光散射法(electrophoretic light scattering),透射电镜法(Transmission Electron Microscope),蛋白浓度检测法(bicinchoninic acid)和蛋白印迹法(western blot)分析提取的外泌体的形态、浓度、稳定性和纯度。
三种商品化试剂盒均成功提取出了外泌体,在回收率和纯度上Exo-spin表现最佳。且相对于差速离心法,三种商品化试剂盒对样本的体积要求量较低。
TEI:Total Exosome Isolation™(品牌:Invitrogen)
ExoQ:ExoQuick™(品牌:System Biosciences)
ExoS:Exo-spin(品牌:Cell guidance systems)
01 粒径与形态分析
除使用三种商品化试剂盒提取外泌体外,该团队还用差速离心法基于同等体积的样本进行提取。但差速离心法得到的外泌体样本浓度均低于NTA建议的检测区间下限(1e7 particles/ml)。
三种试剂盒提取得到的外泌体样本粒径分布均符合外泌体粒径范围。TEM结果也证明通过三种试剂盒,外泌体均被成功提取。
三种商品化试剂盒外泌体提取产物的粒径-浓度分布图
三种商品化试剂盒外泌体提取产物的透射电镜图
02 外泌体浓度分析
除了用NTA方法,该团队另基于acetylcholinesterase(一种已知的外泌体表达蛋白)评估三种试剂盒提取外泌体的得率。从NTA结果看,对于血清和血浆样本,Exo-spin的提取量最高,是其他两种试剂盒的1-3倍;相对来说,脑脊髓液的提取率都比较低,ExoQuick™提取得到的外泌体浓度最低。从基于acetylcholinesterase的分析结果看,其数值高于NTA方法,且Exo-spin得到的外泌体浓度高于其他两种试剂盒。
03 外泌体纯度分析
颗粒数和蛋白量之比可评估外泌体样本纯度,已有报道建议颗粒数和蛋白量之比高于3e10(particles/µg protein)时可认为外泌体为高纯度。本研究用BCA法检测血清和血浆组的蛋白浓度,用microBCA法检测脑脊髓液组的蛋白浓度。如图所示,血清和血浆样本组均高于3e10(particles/µg protein),其中Exo-spin组颗粒数/蛋白量最高,说明Exo-spin提取表现最优。脑脊液组的颗粒数/蛋白量相对较低,与NTA结果一致,且不同试剂盒未体现明显差异。
三种商品化试剂盒外泌体提取产物的颗粒数/蛋白量比值
综上,在回收率和纯度上,Cell Guidance Systems的Exo-spin表现最优;对于成分更为复杂的脑脊髓液样本来说,三种商品化试剂盒的提取效果无太大差别。针对脑脊液中外泌体的提取,Cell Guidance Systems基于Exo-spin,已有优化提取方案的报道,有意可参考:https://doi.org/10.1080/20013078.2017.1369805:Cerebrospinal fluid extracellular vesicle enrichment for protein biomarker discovery in neurological disease; multiple sclerosis。
本文来源:
Soares Martins T, Catita J, et al. (2018) Exosome isolation from distinct biofluids using
precipitation and column-based approaches. PLoS ONE 13(6): e0198820.
Exo-spin部分其他文献:
1 Ryosuke Kojima, Daniel Bojar, et al.(2018) Designer exosomes produced by implanted cells intracerebrally deliver therapeutic cargo for Parkinson’s disease treatment. Nature Communications(9):1305
2 E. Ghazizadeha, Zahra Naseria, et al.(2018) A fires novel report of exosomal electrochemical sensor for sensing micro RNAs by using multi covalent attachment p19 with high sensitivity . Biosensors and Bioelectronic . 113 :74-81
3 Y J Piao, H S Kim, Joanne L. Welton a,b,c, Samantha Lovelessc,
Breast cancer cell-derived exosomes and macrophage polarization are associated with lymph node metastasis. Oncotarget, 9(7): 7398-7410
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