细胞衰老的秘密你知道多少?
细胞衰老的秘密
你知道多少?
“长生不老”一直是神话故事、电影小说里必不可少的题材。从几千年前的秦始皇百炼丹,到现在科学家们探索和研究,无一不展现了人类对于抵抗衰老的执着以及对衰老背后秘密的渴求。到底是怎么样的机制调控衰老,我们又是否可以突破时间的牢笼…本文以细胞衰老的不同类型和检测方法,为大家介绍目前研究已经触及到的细胞衰老的秘密。
衰老(Senescence),来自拉丁语senex,是指在对各种应激反应后细胞发生不可逆的生长停滞,同时伴随功能的失调。我们有理由认为人类的衰老至少有一部分是由于细胞衰老引起的,想在人体内进行研究是几乎不可能的,但是细胞水平的变化我们是可以把控的。最早对于细胞衰老的定义是基于伦纳德·海夫利克对人类胚胎成纤维细胞的体外培养,他发现其增殖到50代左右便终止增殖,即以永久性增殖停滞为显著特征。大部分物种正常体细胞在体外培养时都不能无限分裂,在分裂一定的次数后处于静止状态,而这个次数也被称为“海夫利克极限”。
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衰老的分类
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XP BioMed
在整个生命过程中,细胞会遇到外源性和内源性的刺激。根据细胞类型、刺激性质和强度,细胞会选择三种途径:修复、死亡或衰老。基于应激发生的细胞衰老可分为复制性衰老(端粒)和应激过度的早衰,不同类型的刺激诱导细胞的衰老具有相同的衰老表型(如图1)。
图1 不同的压力源导致的细胞衰老[1]
复制性衰老
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在目前的细胞培养过程中,细胞衰老可以用细胞的群体倍增次数来量化(注:群体倍增次数(population doubling (PD or pd) number)是细胞种群数量翻倍的近似数。例如,当传代的细胞分裂比例为1:2时,传代数与PD数相等;传代的细胞分裂比例为1:4时,传代数等于2 PDs,以此类推)。细胞的类型、种类和供体年龄都是细胞培养过程中影响群体倍增数量的决定因素。端粒是覆盖在染色体末端的重复DNA序列,保护DNA不被降解或重组,从而维持基因组稳定。由于DNA聚合酶无法复制DNA的末端,所以端粒会随着复制的次数增加而逐步被侵蚀,导致端粒达到临界长度,从而触发DNA损伤,阻滞细胞周期进程并诱发衰老。因此解决端粒的缩短可能可以作为人类抗衰老的方法。
图2 端粒结构示意图(图源网络)
应激诱导的早衰
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除复制性衰老,还有一系列非端粒的刺激因素导致细胞过早衰老,且与端粒的长度无关。“早衰”即指在复制衰老发生的最大群体倍增次数之前,衰老就已经出现,即衰老的进程发生了加速。这些应激包括内源性和外源性,包括活性氧(ROS)产生的氧化应激、基因毒性应激和癌基因的过度激活等。端粒体内外应激的重要靶点,相比于氧化应激和基因毒性应激,癌基因诱导的衰老不影响端粒的长度,即不丧失复制潜能。
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细胞衰老的标志物分析
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XP BioMed
衰老细胞会与正常细胞在某些方面表现出一定的差异性(如图3),我们可以通过不同的方法进行体外鉴定。没有任何标志物是衰老细胞特有的,也不是所有的衰老细胞都表达所有的细胞衰老标志物。
图3 细胞衰老的特征[1]
BrdU 细胞增殖实验
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5-溴-脱氧尿嘧啶核苷 (Bromodeoxyuridine,BrdU)是一种胸腺嘧啶核苷的类似物。当细胞处于细胞周期中的 DNA 合成期 (S 期) 时,BrdU 可以掺入到新合成的 DNA 中。利用抗 BrdU 的单克隆抗体荧光染色,就可通过流式细胞术检测 BrdU 的含量,从而定量细胞群体的增殖情况。细胞衰老的一个重要标志是细胞周期的稳定停滞G1/S期,因此BrdU细胞增殖实验是一种快速、简便、灵敏度高的检测细胞增殖活力的方法。
知识小贴士:细胞周期的介绍
细胞周期(cell cycle)是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程,分为间期与分裂期两个阶段。间期又分为三期,即DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)与DNA合成后期(G2期)。细胞的生命开始于产生它的母细胞的分裂, 结束于它的子细胞的形成,或是细胞的自身死亡。通常将子细胞形成作为一次细胞分裂结束的标志,细胞周期是指从一次细胞分裂形成子细胞开始到下一次细胞分裂形成子细胞为止所经历的过程。在这一过程中,细胞的遗传物质复制并均等地分配给两个子细胞。
图4 细胞周期(图源网络,仅供参考)
● G1期(first gap)从有丝分裂到DNA复制前的一段时期,又称合成前期,此期主要合成RNA和核糖体。该期特点是物质代谢活跃,迅速合成RNA和蛋白质,细胞体积显著增大。这一期的主要意义在于为下阶段S期的DNA复制作好物质和能量的准备。
● S期(synthesis)即DNA合成期,在此期,除了合成DNA外,同时还要合成组蛋白。DNA复制所需要的酶都在这一时期合成。
● G2期(second gap)为DNA合成后期,是有丝分裂的准备期。在这一时期,DNA合成终止,大量合成RNA及蛋白质,包括微管蛋白和促成熟因子等。
衰老相关β-半乳糖甘酶
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β-半乳糖苷酶,一种广为人知的衰老标志物,简直就是“C位大咖”。1995年,Dimiri等人发现,除了在pH 4.0的条件下可以检测到溶酶体的β-半乳糖苷酶,老化的细胞还会在pH 6.0检测到β-半乳糖苷酶,称为衰老相关的β半乳糖苷酶(Senescence-Associated β-galactosidase ,SA-β-gal)。
图5 β-半乳糖苷酶检测细胞衰老情况(图源网络)
常规细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒是一种基于衰老时SA-β-gal活性水平上调而对衰老细胞或组织进行染色检测的试剂盒,以X-Gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)为底物,在pH 6.0条件下,衰老特异性的β-半乳糖苷酶催化会生成蓝绿色产物,从而在光学显微镜下观察到变成蓝色的表达β-半乳糖苷酶的细胞或组织。一般不会染色衰老前的细胞、静止期细胞、永生细胞或肿瘤细胞等。
研究表明,SA-β-gal的表达与溶酶体体积和数量的增加密切相关。脂褐素(lipofuscin),是溶酶体作用后不再能被消化的物质而形成的残余体。已经有试验验证,脂褐素组织化学苏丹黑B(Sudan Black B,SBB)模拟物标记染色与SA-β-gal在衰老细胞中具有共定位的效果,是衰老细胞体外检测另一种指标。
值得注意的是,并不是所有细胞的衰老都表达SA-β-gal,比如GM1神经节苷脂贮积症是β-半乳糖苷酶缺乏而引起的一种遗传性溶酶体疾病,其患者的成纤维细胞在衰老状态不表达SA-β-gal。
衰老相关的异染色质
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异染色质(heterochromatin)是指在细胞周期中具有固缩特性的染色体。衰老的开始会产生不同染色质结构的积累,称为衰老相关的异染色质病灶(senescence associated heterochromatin focal SAHF)。衰老细胞的DNA包含异染色质的点状结构域,很容易与非衰老细胞的染色质进行区分。
染色质重组与衰老相关的异染色质病灶(SAHF)形成和持续性 DNA 损伤可用于鉴定衰老细胞。
图6 常规和异常染色质的区别(图源网络)
SAHF 的标志物可以通过DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)与DNA强力结合的荧光染料检测,或者相关蛋白比如异染色质蛋白 1(HP1) 和 赖氨酸 9 二或三甲基化组蛋白 H3(H3K9Me2/3) 等进行免疫组化检测。尽管SAHF在衰老时经常观察到,但一些细胞出现衰老时并不形成SAHF。
核纤层蛋白B1(Lamin B1)是核纤层蛋白家族重要成员之一,其主要功能在于维持细胞核骨架完整性,并通过影响染色体分布、基因表达及DNA损伤修复等参与细胞的增殖和衰老,其表达量的下调是细胞衰老的另一个重要特征。
图7 核纤层蛋白BI免疫荧光结果(图源网络)
衰老相关分泌表型
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衰老细胞会分泌大量的因子,包括促炎细胞因子和趋化因子、生长调节剂、血管生成因子和基质金属蛋白酶等,统称为衰老相关分泌表型(Senescent Associated Secretory Phenotype, SASP)。SASP是衰老细胞的另一个典型标志之一,它介导了许多衰老细胞的病理生理效应,促进细胞与周围环境的交流,最终影响衰老细胞的命运。
图8 细胞衰老相关分泌表型(图源网络)
在细胞衰老进程中,SASP的分泌是一个动态过程, 可分为以下三个阶段:第一阶段在DNA损伤后立即开始,并持续36 h,但不足以导致衰老;第二阶段是“早期”SASP的形成,在诱发细胞衰老后数天,开始出现最重要的SASP因子,例如IL-1α;第三阶段是“成熟”SASP的形成,在接下来的4~10天内,通过正反馈回路对转录进行调控,使大多数因子的分泌增加,最终形成“成熟”的SASP。
图9 细胞衰老相关分泌表型的变化情况(图源网络)
目前已有很多SASP相关的研究,且对SASP调节途径的研究不断丰富。但仍需在SASP通路、分子之间的内在联系,以及SASP影响衰老及衰老相关疾病的具体机制等开展大量研究。
基因表达的改变
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在细胞衰老过程中,基因表达会发生极端变化,尤其是细胞周期抑制和细胞周期激活的相关基因。细胞周期蛋白依赖激酶(CDKs)和细胞周期蛋白(Cyclins)是整个细胞周期调控机制中的核心分子,衰老细胞中Cyclins的相关基因表达会被抑制,而CDKs会被过度表达。因此,这些基因表达的是衰老细胞的常见标志。
例如p21能够与一种细胞周期蛋白(cyclin)、某几种细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)——比如CDK2,CDK4或CDK6构成复合体,抑制CDK的激酶(磷酸化酶)活性,细胞周期从而被阻碍在G1期而不能进入S期,导致不可逆转的细胞周期停滞。
细胞衰老过程中基因表达模式存在多个动态变化轨迹,存在保守性,且不同衰老类型中存在较大的异质性。近年来关于该方面的研究也层出不穷,对细胞衰老过程中基因表达模式及变化规律提供了更多的新认识。
图10 细胞周期蛋白与激酶的介绍(图源网络)
结语
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在体内,由于衰老细胞存在于各种组织中。不同组织的状态、细胞衰老类型都有所区别,所以目前还没有针对衰老细胞的绝对特异性的单一标志物。除了我们熟知端粒学假说,近几年有学者基于端粒DNA和核糖体DNA(rDNA)能够结合多种蛋白质影响p53的发现,提出细胞端粒DNA和核糖体DNA(rDNA)共调控假说。
细胞衰老的积累导致多种疾病的产生,比如癌症、阿尔兹海默症等,其涉及的信号通路更是数不胜数。人类对于衰老的研究从古至今,热情不减,相信只要人类还没永生,衰老将会是永恒的研究热点。
参考文献:
[1] Mohamad Kamal NS, Safuan S, Shamsuddin S, Foroozandeh P. Aging of the cells: Insight into cellular senescence and detection Methods. Eur J Cell Biol. 2020 Aug;99(6):151108.
END
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