终结篇——外泌体研究合集
外泌体的神秘面纱已经全面揭开,研究热潮席卷而来。从上游到下游的外泌体相关产品与服务的公司遍地开花,各类国家课题基金申请的外泌体相关中标数量逐年升高,想要从“大蛋糕”里分走一块尝尝鲜,需要把握外泌体的整体研究思路,并针对研究样本和目的设计合理的外泌体研究方案。2021年接近尾声,小希给各位全方位的理一理外泌体研究的思路,蹭一蹭外泌体的热度过个冬!
图1 外泌体研究整体思路
外泌体——基础知识篇
细胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs)是指细胞主动分泌的具有膜结构的微小囊泡的统称,几乎所有的细胞都会分泌EVs,然而EVs最初被认为是细胞向外排泄的“垃圾”,是细胞移除碎片和清除特定大分子的一种途径。根据大小、生物特性和形成过程的不同,EVs主要分为外泌体(exosomes)、微囊泡(microvesicles)、和凋亡小体(apoptotic bodies)三大类。近十年来,研究学者重新认识了EVs的重要性,越来越多的研究发现EVs可以作为遗传信息的传递者,携带和传递信号分子运输到相邻远处的细胞,从而调节细胞的生理和病理的状态,参与许多疾病的发生发展过程,其中对于外泌体的研究最为火热。
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一、外泌体的样本来源
由于研究细胞分泌的外泌体,需要避免培养基中其它外源性外泌体对细胞分泌外泌体的影响,目前采用以下方法获取研究样本:血清饥饿培养、去外泌体血清培养、无血清体系培养、其它样本来源。
01 血清饥饿培养
一般是指通过降低培养液中的血清浓度,使所培养的细胞因缺乏血清中的生长因子而不能分裂,这个操作常用来做细胞同步化分裂。常规操作就是在细胞培养至融合度为50-60%左右,撤去含血清的完全培养基,更换为基础培养基进行饥饿培养细胞至融合度为80%左右,收获细胞上清进行下游的研究。但血清饥饿培养收获的外泌体量有限且质量较低。
更多饥饿培养相关的信息,请点击阅读:外泌体研究|您的细胞还在挨饿吗?
02 去外泌体血清培养
为了减少或避免血清饥饿培养对细胞分泌外泌体的影响,去外泌体血清培养细胞成为大多数学者选择的一种方式。去外泌体血清可适用于大部分细胞培养,基本可维持与正常胎牛血清中相同生长速率和形态。在使用各种方法去除胎牛血清中大部分的外泌体后添加至培养基中配制成去外泌体血清完全培养基,应用于细胞外泌体的研究。
03 无血清体系培养
从饥饿培养到去外泌体血清培养,再到无血清体系培养。这是针对外泌体研究所做出的培养基改善与优化。也让学者们能够了解到细胞培养所需要的营养成分。目前无血清体系的培养基可分为含血小板裂解物(含外泌体)的无血清培养基、配方明确的无血清培养基等,其中配方明确的无血清体系让研究细胞外泌体的结果更加准确。 更多无血清体系的信息,请点击阅读:带您了解无血清培养基~ 除了细胞来源的外泌体样本研究最为广泛,血浆、血清也是多数学者的研究样本,其它的样本包括唾液、脑脊液、乳汁、尿液等生物体液,均可以作为外泌体研究的样本来源。 更多外泌体样本来源的信息,请点击查阅:外泌体样本收集那些事~ 二、外泌体的富集 目前采用2D培养方式收获大量细胞上清的学者占多数。这种方式收获的细胞上清中颗粒浓度低,样本体积大,后续的纯化成本、人力、物力消耗大。但对于基础研究,基本2D培养方式获得的外泌体样本量就可以满足。另外需要考虑的是不同细胞培养方式可以刺激细胞产生不同表征或内含物的外泌体。所以3D培养方式通过模拟体内环境让细胞更好地伸展,正确表达或分泌的外泌体量较2D培养方式要更多。各类的生物反应器(例如FiberCell系统等)或细胞外基质涌现在大众面前,可根据实际研究需要选择合适的设备或试剂进行外泌体的富集。 更多外泌体富集相关的信息,请点击阅读:【外泌体研究】FiberCell为您富集高浓度的外泌体 三、外泌体的提取/纯化 作为新兴研究领域,外泌体研究的技术方法正在走向标准化。国际细胞外囊泡学会(ISEV)分别在2014年和2018年发表了EVs的研究方法与质控标准。但如何获得高质量的外泌体样本一直是外泌体相关基础研究和临床应用的瓶颈问题之一。目前已经报道的外泌体提取/纯化的方法包括:超速离心法、超滤法、尺寸排阻色谱法、沉淀法、免疫亲和分离法(免疫磁珠法、微流控技术)等。不同提取方法获得的外泌体质量不一,且结果可能不可重复。总之,没有单一的提取方法适合所有外泌体的研究目的,组合的外泌体提取/纯化方法逐渐成为一种趋势。正确获得高质量的外泌体,提高实验研究的准确性和可靠性。可根据实验研究样本类型与体积选择合适的提取方法获取高质量的外泌体样本。 图2 尺寸排阻色谱法原理示意图 更多外泌体提取/纯化方法的信息,请点击查阅:“组合”的分离方法助您提取高质量的外泌体 四、外泌体的特征鉴定 根据ISEV在2014年发表的指导手册(MISEV),对于获得的外泌体样本需要做以下鉴定: 纳米颗粒示踪分析(NTA):观察样本中外泌体的粒径和浓度情况; 透射电镜(TEM):观察外泌体的形态特征; 蛋白免疫印迹实验(WB):鉴定外泌体的表面标志蛋白表达情况。 图3 NTA检测结果(左一),TEM检测结果(中),WB检测结果(右一) 更多外泌体特征鉴定的技术服务信息,请关注逍鹏生物微信公众号下单。 五、外泌体的下游分析 经过上面的检测可对外泌体验明正身,就可以在蛋白水平和核酸水平对其进行深入分析。外泌体携带大量功能性的miRNA、少量mRNA、IncRNA,以及特异性的蛋白质(例如细胞因子、生长因子)等生物活性物质,用于参与细胞之间通讯、细胞迁移、参与各种疾病的过程等。不同细胞来源的外泌体所含的蛋白成分和RNA不太相同,可作为多种疾病的早期诊断标记物,也能作为靶向药物的载体进行疾病治疗。 目前外泌体的下游分析包括: 外泌体高通量测序:研究方向为表达谱、分子标志物、分子机制等。包括miRNA测序、mRNA测序、IncRNA测序、cicRNA测序。 图4 外泌体高通量测序-差异分析图 外泌体蛋白组学分析:研究方向为疾病发病机制、疾病诊断和预后的生物标志物、筛选疾病治疗靶点等。包括定性技术(Shotgun)、定量技术(TMT/iTRAQ/Label Free/DIA)、修饰技术(磷酸化、糖基化、乙酸化、泛素化)。 图5 外泌体蛋白组学分析-韦恩图 更多外泌体蛋白组学相关的信息,请点击查阅:【外泌体研究】蛋白组学研究思路 外泌体标记/示踪:研究方向为外泌体的体内生物分布、生理功能、迁移和靶向机制等。包括磁成像示踪(MRI)、计算机断层扫描示踪(CT)、核成像示踪、光声成像示踪、荧光成像示踪(亲脂性染料标记、慢病毒标记)、生物发光成像示踪(BLI,荧光素酶-底物反应)。 外泌体功能鉴定:研究方向为外泌体参与细胞共培养、细胞迁移与侵袭、细胞凋亡等,以及动物体内注射后表型变化和其它指标检测。 外泌体临床研究:研究方向为药物递送载体、早期临床诊断、各类疾病治疗、医美领域等。 外泌体研究除了必备的“硬件”操作技术与检测设备,同样具有“软件”的数据库知识供全球外泌体研究学者参考。今天就给大家列举8大外泌体数据库,为您的外泌体研究增添灵感。 ExoCarta是首个外泌体标志物综合数据库,由Simpson教授团队建立,具有外泌体蛋白动态的蛋白与蛋白之间相互关系网及生物学通路。用户可从大量研究中下载最常用的蛋白数据。 02 exoRBase——人体液外泌体长链RNA-Seq数据库 exoRBase数据库收集和描述人类体液中所有长链RNA,目前包含19643 个mRNA、15645个IncRNA和79084个cicrRNA,提供注释、表达水平和可能的来源组织。 一种EVs的miRNA数据库,收录了17种器官或疾病的462个sRNA测序数据集,包括miRNA表达谱、miRNA调节途径、miRNA函数、miRNA相关药物及相关文献,为EVs的miRNA研究提供重要资源。 04 EVpedia——外泌体蛋白质组、转录组和脂质体数据库 EVpedia是由韩国项浦大学创建的一个完整而全面的蛋白质组、转录组和脂质体数据库,其来源包括原核和真核生物。这个免费的数据库可以作为EVs研究进展的一个基本资料库,有助于阐明EVs的新功能。 05 Vesiclepedia——外泌体蛋白质、RNA和脂质数据库 Vesiclepedia数据库是公开的,允许用户根据不同的搜索标准查询和下载EV cargo、EV分离和表征模式,生物物理和分子特性以及EV-METRIC,帮助生物医学科学家评估EV制剂的质量,获得相应的数据。 EMBL-EBI即为欧洲生物信息学研究所,拥有世界上最全面的免费和最新的分子数据资源。该数据库与ExoCarta和Vesiclepedia紧密合作,识别用于聚焦注释的靶蛋白以及外泌体实验方法学的注释。 EV-TRACK是以大牛Thery为首的EV-TRACK联盟建立的EVs研究透明报告在线数据库,其中包括EVs相关文献的方法学参数,基于MISEV评估EVs分离及鉴定相关参数。便于提高外泌体实验研究的规范性和结果的可靠性。 08 Urinary Exosome Protein Database——尿液外泌体蛋白质数据库 这个尿液外泌体蛋白质数据库是基于上皮系统生物实验室(ESBL)已发表的蛋白质质谱数据建立的数据库。所有数据均来源于健康志愿者的尿液外泌体,这个数据库包含了用两种不同的质谱仪来鉴定人类尿液外泌体的蛋白质。 外泌体——参考文献篇 对于科研工作者来说,想要快速get某个领域的基础或关键信息,莫过于阅读该领域最权威、最全面的文献综述了。外泌体的重要性决定了它可以在很多研究领域站住脚,文章就是最直接的体现。小希为外泌体研究工作者整理了8篇必读文献和不同研究领域内可接收外泌体相关研究发表的杂志,让您充分地了解到外泌体就在身边,就在眼前。 “Exosomes: composition, biogenesis and function.” 【Nat Rev Immunol】 上榜理由:这篇文献是外泌体领域大牛Thery发表的最早、较为全面的外泌体综述。描述了外泌体的物理性质,总结了外泌体的生物学效应及其作用。 “Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.” 【J Cell Biol】 上榜理由:这篇文献作者是Raposo,同样是外泌体领域大牛。相对较早、较全面的阐述了EVs的特性和形成过程极其功能的相关机制。 “lsolation and charaterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.” 【Current Protocols in Cell Biology】 上榜理由:这是大牛Thery的另一篇关于外泌体分离提取鉴定的最原始、最权威的文献。详细描述了不同样本来源的外泌体分离提取方法,且对外泌体制剂进行评价。 “Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.”【Annu Rev Cell Dev Biol】 上榜理由:这是Thery和Raposo两位大牛的合作。详细阐述了外泌体的生物发生、分泌及其后续的功能等。配图非常值得保存学习! “Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.” 【J Extracellular Vesicles】 上榜理由:本文作者由来自57个不同工作单位的61位大佬组成,参考的文献数量为175篇,文章内容全面。综合描述了各种组织和体液中EVs的内含物和功能,以及不同生物与植物中EVs的生理机制。值得大家下载打印出来细读。 “Exosomes:Vesicles of Intercellular Signaling, Biomarkers, and Vectors of Cell Therapy.” 【Annu Rev Physiol】 上榜理由:外泌体不仅内含物丰富,同样可以作为载体运输大量的蛋白质、脂质和核酸等,进而改变细胞和器官的功能。本文着重于介绍外泌体作为干细胞治疗载体的潜力。 “New Technologies for Analysis of Extracellular Vesicles.” 【Chemical reviews】 上榜理由:这篇杂志的影响因子高达47.928分,更是全面总结了细胞外囊泡的研究方法及其临床应用,参考文献近300篇,各种配图十分详细。又是一篇值得打印出来细读的文献。 “Communication by Extracellular Vesicles: Where We Are and Where We Need to Go.” 【Cell】 上榜理由:看到Cell,文章必然厉害,再看作者又是大牛Thery,必须细品。本文主要关注外泌体与肿瘤细胞的微环境之间的关系,这层关系同样适用于EVs介导的其它生理过程。 以上大牛们的文献是否能够满足您对外泌体的基础了解呢?是否已经摩拳擦掌准备做实验发表文章了?下面再给大家看看哪些杂志可以接收外泌体研究的paper~ 结语 外泌体,一个新型的研究热点,已然成为生命科学领域的“宠儿”。在精准医学与疾病诊断治疗的进程中,外泌体将释放无穷无尽的力量。 这一年,我们依然口罩蔽体;这一年,我们依靠磅礴力量;这一年,我们依旧风雨兼程为生活。 下一年,我们仍会戴好口罩;下一年,我们仍旧砥砺前行;下一年,我们仍要撸起袖子加油干。 参考文献 Kalluri R, LeBleu VS. The biology, function, and biomedical applications of exosomes[J]. Science. 2020, 367(6478): eaau6977. Stam J, Bartel S, Bischoff R, et al. Isolation of extracellular vesicles with combined enrichment methods. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2021, 1169: 122604. Gobin J, Muradia G, Mehic J, et al. Hollow-fiber bioreactor production of extracellular vesicles from human bone marrow mesenchymal stromal cells yields nanovesicles that mirrors the immuno-modulatory antigenic signature of the producer cell. Stem Cell Res Ther. 2021, 12(1): 127.
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