【外泌体研究】蛋白组学研究思路
细胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs)携带大量的细胞特异性的生物活性分子,核酸、蛋白质、脂类和糖类等,在机体很多生理病理过程中发挥重要的作用。外泌体可通过传递信息影响靶细胞的功能,激活细胞信号通路,在免疫、凝血、肿瘤等生理病理过程中发挥作用。EVs甚至可能通过携带聚集蛋白传播疾病,如神经退行性变疾病。
蛋白质的差异表达是区分不同来源外泌体的重要特点,是研究外泌体起源的重要途径。蛋白质组学已经逐渐成为研究各种亚细胞组分蛋白质组的重要工具。针对外泌体进行蛋白质组学研究,可以揭示疾病发病机制、寻找疾病诊断和预后的生物标志物、筛选疾病治疗靶点等。
近20年来外泌体蛋白质组学研究发表文章趋势
(数据来源:PubMed,数据至2021年7月)
外泌体中的蛋白质居多,外泌体蛋白质组学应用广泛,研究外泌体蛋白质在免疫调节、抗原呈递、癌症转移、肿瘤浸润、血管生成、神经发育中的生物学功能,标志物的筛选与鉴定、药物靶点的发现以及功能机制中的作用以及疾病诊断、治疗和预后等。
案例一:通过定量蛋白质组学鉴定人转移性黑色素瘤组织细胞外囊泡亚群
转移性黑色素瘤组织酶处理后,差速超速离心分离出不同大小的细胞外囊泡,然后将其进一步分为高密度(HD)和低密度(LD)部分。然后使用电镜、NTA和TMT定量质谱分析对所有EVs亚种群进行深入分析。
TMT定量蛋白质组学结果显示,大型和小型LD EVs均富集了flotillin-1等几种蛋白质,ADAM10仅富集在小型LD EVs中,而mitofilin仅富集在大型EVs中。
聚类分析结果表明HD EVs 和LD EVs中蛋白表达差异。
案例二:外泌体来源ENO1调节整合素α6β4表达促进肝癌生长和转移
α-烯醇化酶(ENO1)在几种人类恶性肿瘤中被发现失调,包括肝细胞癌(HCC)。
文章证明ENO1在HCC细胞或组织中上调,在高转移性HCC细胞或转移性组织以及来源于高转移源的外泌体中表达更高。
ENO1表达与肝癌患者的肿瘤淋巴结转移(TNM)分期、分化程度和不良预后有关。ENO1可以通过外泌体介导在HCC细胞之间转移,表现出类似于HCC细胞中ENO1过度表达的效果,其通过上调整合素α6β4表达和激活FAK/Src-p38MAPK通路促进ENO1低表达HCC细胞的生长和转移。
数据表明,外泌体来源ENO1对于促进肝癌生长、转移和进一步恶化患者至关重要。这项研究发现了一种新的生物标志物用于临床评估肝癌进展,特别是预测肝癌转移风险。
通过蛋白质组学分析确定ENO1在LO2exo、HepG2exo、MHCC97Lexo和HCCLM3exo中的表达水平及差异表达。
#TMT,#DIA,#4D Label Free,#Shotgun
✦TMT标记定量蛋白组学
TMT (Tandem mass tag)是由ThermoFisher Scientific公司研发的一种多肽体外等重同位素标记的相对与绝对定量技术,采用6、10及16种同位素的标签,通过特异性标记多肽的氨基基团,经高分辨质谱仪串联分析,可同时比较多达16种样品之间的蛋白质表达量,是定量蛋白质组学中经典的高通量筛选技术。
同一批次标记的样本统一处理,减少人为操作和实验系统不稳定造成的偏差,实验平行性较高;
同一批次标记定量稳定性高;
通过分级方法增加蛋白鉴定深度。
疾病标志物筛选
分子机制研究
植物抗逆研究
药物作用靶点研究
特殊功能蛋白质筛选
✦DIA蛋白质组学
DIA(data-independent acquisition,数据非依赖性采集)技术是新一代蛋白质组学分析技术,被Nature Methods杂志评为2015年最值得关注的技术。
DIA采用数据非依赖性扫描模式:将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口,然后对每个窗口中的所有离子进行检测、碎裂,从而无遗漏、无差异地获得样本中所有离子的信息。从而降低样本检测的缺失值,同时提高定量准确性和重复性,实现大样本队列中高稳定,高精准的蛋白质组定量分析。
与DDA(data dependent acquisition,数据依赖性采集)技术相比,DIA技术的优势包括:
(1)数据采集更完整;
(2)减少采集的随机性,检测重现性、稳定性更好;
(3)更能检测到低丰度信号。
DIA与DDA数据采集模式的区别
✦Label free 蛋白质组学
Label free是一种不依赖于同位素标记的非标记蛋白组定量技术,通过液质联用技术对蛋白质酶解肽段进行质谱分析,无需使用昂贵的稳定同位素标签做内标,只需分析大规模鉴定蛋白质时所产生的质谱数据,比较不同样品中相应肽段的信号强度,从而对肽段对应的蛋白质进行相对定量。
TMT、Label Free、DIA如何选择
✦Shotgun
Shotgun(鸟枪法)是定性鉴定蛋白质混合物中蛋白质组成最常见、最方便有效的方法。
将样本中的蛋白质酶解成肽段,经液相色谱分离进入质谱仪后先记录其一级信号,随后外加能量将其碎裂后再记录其二级信号。采用相应的软件还原样本中的蛋白质组信息。
可全面鉴定复杂混合样品的大量蛋白质。
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参考文献
Rossella C. et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation.Journal of Extracellular Vesicles. 2020,9:1.
Keqiu Jiang. et al. Exosome-derived ENO1 regulates integrin α6β4 expression and promotes hepatocellular carcinoma growth and metastasis. Cell Death & Disease. 2020,11:972.
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