外泌体研究思路攻略，高分文章发起来！

2021-06-08 17:21

1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，最初被认为只是一种细胞的废弃物。1987年Johnstone将其命名为“Exosome”，即外泌体。外泌体(Exosome) 是一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡，分布于外周血、尿液、唾液、腹水、羊水等体液中。外泌体内含有与细胞来源相关的蛋白质和核酸，可以运输蛋白质、mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA等进入受体细胞，参与细胞间通讯。不同细胞来源的外泌体所含有的蛋白成分和RNA不太相同，通过高通量技术对外泌体 RNA 进行测序，可快速高效获得外泌体 RNA 的全面信息，是疾病诊断和随访的理想手段。

【image ref：Schorey JS. EMBO Reports. 2015;16(1):24-43. 】

外泌体近年来有很多高分文章，重要研究思路包括：基础研究（信号转导、运输机制、生物学功能）和转化医学（biomarker、靶点治疗、给药载体）。

外泌体常规整体研究思路

01 样品收集与预处理

外泌体几乎存在于所有生物体液中，包括血液、唾液、尿液、滑液、羊水、乳汁、细胞培养液等。我们可以选择不同的样本来源进行相关的外泌体研究。为了获得高纯度的外泌体，必须确保有效去除所有的细胞碎片及其他杂质。

【image ref：A.IBRAHIM ET AL / AR PHYSIOLOGY 2016】

不同的实验样本采集时需要注意不同地方，如细胞培养上清在收集样本前使用去除外泌体的血清（如去外泌体胎牛血清,Exosome depleted Fetal Bovine Serum, VivaCell P/N: C38010050 ）或者无血清培养基，以降低背景值的干扰（牛血清中含有大量牛源外泌体）。

02 外泌体分离与保存

目前主要根据外泌体的大小、密度、免疫特性等特点进行外泌体的分离。分离出高纯度的外泌体是进行后续外泌体研究的关键步骤，外泌体分离方法主要包括以下几种：

差速超速离心、密度梯度离心、超滤、免疫磁珠法、试剂盒提取。

差速超速离心是目前高分文章比较认可的一种方法。提取的外泌体在短时间使用，可以放在4℃保存，如果需长时间保存可以放在-20℃或-80℃中。

CellGS Exo-spinTM外泌体纯化试剂盒

只需三步简单操作，30min-3h分离得到完好的外泌体，可用于研究RNA及蛋白质组学分析。

03 外泌体鉴定

国际细胞外囊泡协会发布的指南（《MISEV 2018》(查看下载全文)）给定了三个实验联合鉴定外泌体的方法：① 粒径（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA）, 验证粒子直径分布是否符合外泌体定义；②透射电镜（Transmission Electron Microscope，TEM）观察样品中是否有与外泌体相似的经典结构；③ 蛋白标志物（Western Blot, WB）验证样品中是否具有外泌体的标志物蛋白。

① 外泌体浓度粒径分析（NTA）

NTA（Nanoparticle Tracking Analysis），原理是对每个颗粒的布朗运动进行追踪和分析，结合Stockes-Einstein方程式计算出纳米颗粒的流体力学直径和浓度。NTA技术已被外泌体研究领域认可为外泌体表征手段之一；相较于其他表征方式，NTA技术的样本处理更简单、更能保证外泌体原始状态、检测速度更快。