外泌体样本收集那些事~
Exosome
日益火爆的外泌体Exosome，在肿瘤等疾病的基础研究、转化应用和诊断治疗中展现出巨大的潜力，在国自然项目中，外泌体的中标项目及资助金额也是节节飙升，成为国自然热点之一。
外泌体几乎存在于所有生物体液中，包括血液、唾液、尿液、滑液、羊水、乳汁、细胞培养液等。目前研究发现外泌体中富含核酸（microRNA、lncRNA、circRNA、mRNA、tRNA等）、蛋白、胆固醇等。外泌体的表面marker主要有CD9、CD63、CD81、TSG101、HSP70等。
图1：外泌体来源
（图片来源：A.IBRAHIM ET AL / AR PHYSIOLOGY 2016）
Chris Gardiner等2016发表的调查报告有报道细胞培养上清液是最常用来提取外泌体研究，除了细胞上清最常见的体液是血浆(47%)、血清(22%)、尿液(14%)、脑脊液(8%)和乳汁(5%)。
图2 ：外泌体研究用起始材料
（图片来源：J Extracell Vesicles. 2016）
逍鹏生物在2019 CSEV 会议（第三届全国细胞外囊泡大会）上做过调查问卷，关于研究用外泌体来源趋势与文献报道比较一致。最常用来源依次是细胞培养液、血清/血浆、唾液/尿液等。
图3 ：外泌体研究用起始材料
（图片来源：2019 CSEV会议调查问卷外泌体来源，约200例有效问卷）
逍鹏生物Dr.Cell实验室从2019年外泌体NTA检测样本中统计分析了其中1260例，对其外泌体来源进行分析，结果如图4，统计结果表明外泌体来源趋势与以上文献报道以及调查问卷结果基本一致。NTA检测样本的外泌体最常用来源依次是细胞培养液、血浆、血清、组织、尿液等。
图4 ：外泌体样本来源
（图片来源：Dr.Cell 2019年外泌体NTA检测样本，约1260例样本）
俗语说，良好的开端是成功的一半，领先一步，占尽先机！对于外泌体研究，第一步也是相当重要的一步就是收集制备外泌体样本，那么如何有效地收集各种类型的样本用于后续的外泌体分离呢？关于不同的试验、不同的样品，取样的注意事项有哪些呢？又需要经过哪些预处理才能保存呢？
下面小编将与大家一起来探讨上述介绍的最常见外泌体来源类型样本的收集方法。
01 细胞上清 Cell culture supernatant
关于细胞培养上清液，首先需要确定的是细胞的身份验证以及支原体与微生物污染。国际细胞外囊泡协会于2018年在会刊Journal of Extracellular Vesicles发表了新版的《指导要求》，即《MISEV 2018》(下载全文)。在描述收集和预处理过程中需要注意的可控变量中，注明所有细胞研究都建议采取一些预防措施，如定期确认细胞身份（短串联重复序列STR分析或其他方法），鉴定细胞品系和来源。另外需要定期检测支原体、微生物污染，不仅因为污染对细胞的影响，还有污染物也会分泌细胞外囊泡（详细信息查阅：外泌体研究之细胞鉴定 ）。
另外需要注意的是：细胞培养基必须使用去除 exosome的血清（如去外泌体胎牛血清, Exosome depleted Fetal Bovine Serum, VivaCell P/N: C38010050 ）或者无血清培养基，以降低背景值的干扰（牛血清中含有大量牛源外泌体）。
细胞上清
1)细胞在正常含有血清的培养基中培养一定时间，细胞增长至约70%；
2)对于贴壁细胞，去除原有培养基，用PBS洗涤，更换新的含去外泌体血清的培养基或者无血清培养基；对于悬浮细胞，300×g，4℃，10分钟收集细胞，用PBS洗涤，使用不含外泌体的培养基或者无血清培养基悬浮细胞并继续培养；
3)细胞继续培养24-48小时，根据细胞的生长速度确定收取上清时间；
4)收集细胞上清，300×g，4℃，离心10分钟；小心吸取上清，注意避免吸入细胞或者细胞碎片；
5)上清0.22µm过滤，去除细胞碎片、凋亡小体和微囊泡；
6)将上清样本冻存于-80℃。
建议送样量：20ml以上
02 血浆 Plasma
1)取全血至EDTA抗凝管中，轻柔混匀；
2)4°C条件下，2500×g，离心15min，取上清；
3)再次2500×g，离心15min，取上清即为血浆；
4)血浆于-80°C保存。
建议送样量：2ml以上
03 血清 Serum
1)将4ml全血置于普通采血管中（注意收集血清样本不要加入抗凝剂）37℃凝固20-30 min；
2)2000×g离心10 min，取上清，淡黄色透明液体即为血清；
3)将血清置于-80°C保存。
建议送样量：2ml以上
04 尿液 Urine
1)无菌容器收集清晨第一次尿液50ml；
2)加入蛋白酶抑制剂混合物（1.67 ml of100mM NaN3, 2.5ml PMSF (2 mg/ml in isopropyl alcohol), 50 µl Leupeptin (1 mg/ml in ddH2O)）；
3)立即处理或置于-80°C保存。
建议送样量：20ml以上
05 脑脊液 Cerebrospinal fluid
1)收集脑脊液，放置冰上静置30min；
2)4℃ ，2000×g，离心10分钟，去除细胞或细胞碎；
3)取上清，立即处理或置于-80°C保存。
建议送样量：10ml以上
