外泌体研究 | 高通量提取外泌体
外泌体是一种由细胞分泌的细胞外囊泡,并广泛存在于各类生物提取液中,是细胞间信息交流的途径之一。随着更多的学者涌入外泌体领域,不断挖掘外泌体的各种功能,研究潜力巨大。
但是对于外泌体相关的临床应用发展较慢,主要存在的技术障碍:一是如何获得细胞分泌的外泌体;二是外泌体大量提取的标准化与提取产率。面对第一个技术问题,大多数研究学者采用来源更加明确的无血清培养体系或去外泌体血清体系,减少外源性外泌体对实验的干扰,基本可以获得目的性外泌体开展下游研究。而第二个问题仍然是外泌体临床应用发展的重要阻碍。
今天小希就来给您安利一个可以高通量提取外泌体的方法,还有详细的操作视频供您参考哟~
一、Exo-spinTM 96 (Cat# EX07-96)
英国Cell Guidance Exo-spinTM试剂盒,使用经验证的尺寸排除色谱(Size Exclusion Chromatography, SEC)方法,将微型色谱柱技术应用于96孔板形式中,可在30分钟内处理多达96个单独的样品,且单个样品起始纯化量达到0.5 ml。
该套试剂盒用于处理血液样本(血清/血浆),灵活性强,可从96孔板上卸下一条8孔的纯化柱,因此也可以根据需要在96孔板上选择合适数量的纯化柱进行实验研究。
1.原理介绍
尺寸排除色谱(SEC)是一种根据粒径大小分离溶液中颗粒的方法,SEC柱采用树脂填充的多孔球形珠(模式图如图1所示)。当含有外泌体的溶液加入到SEC柱中时,较小的颗粒将会被捕获在孔中,而较大的分子则不会进入孔中先被洗脱。因此首先洗脱下来的是大分子,小分子或颗粒会滞留在孔中,需要长时间才能洗脱下来。
▲图1 SEC柱模式图
2.Exo-spinTM 96主要特点
高通量—30分钟可完成96个样品的外泌体分离
灵活性—模块化设计,可处理小样本量(8的倍数)
处理—单个血浆或血清样品量可达0.5 ml
纯化—可去除高达97%的游离蛋白
高效的再现性—+/- 5%标准差,多次外泌体纯化实验均一致
方便—纯化的外泌体可直接洗脱到96孔板中,便于高通量的下游应用
3.手把手教您使用Exo-spinTM 96
本试剂盒适用于处理血液样本,每柱100 μl血清或血浆的起始量,体积小于100 μl的样品用PBS稀释至100 μl。简要步骤可分为:
(1)去除样本中细胞和细胞碎片
(2)平衡色谱柱
(3)添加样本,较大颗粒洗脱及丢弃
(4)外泌体洗脱及收集
▲图2 高通量提取外泌体简要步骤
4.产品数据
(1)一致性测试
▲图3 外泌体的NTA表征
使用Exo-spinTM 96分离外泌体,并用ZetaView®仪器进行分析。图3A显示的是平均粒子浓度绝对值;图3B数据显示的是8个色谱柱结果,重复性良好。
(2)纯度测试
使用Exo-spinTM 96试剂盒获取包含外泌体的初始部分后,再向纯化柱中加入5次200 μl的PBS,收集每一次的组分,使用Bradford法测定6种组分的蛋白质含量。蛋白质含量分布表明样品中超过97%的总蛋白量是从分离的外泌体中分离出来。
▲图4 不同组分的蛋白质含量
综上可知,Exo-spinTM 96试剂盒利用尺寸排除色谱法应用于96孔板形式中,可高通量提取外泌体,获得外泌体纯度高,为下游应用提供高质量的外泌体样本。
5.产品应用情况
Exo-spinTM 96试剂盒的色谱柱特性与EX01 Exo-spinTM 相同,分离的外泌体可用于多种下游应用,包括DNA和RNA研究,以及体外和体内功能性外泌体的分析。小希为您整理了几篇参考文献:
RNA analysis:
Wang L., Wang C., Jia X. and Yu J. (2018). Circulating Exosomal miR-17 Inhibits the Induction of Regulatory T Cells via Suppressing TGFBR II Expression in Rheumatoid Arthritis. Cellular Physiology and Biochemistry; 50:1754–1763.
Emanueli C., Shearn AI., Laftah A., Fiorentino F., Reeves BC., Beltrami C., Mumford A., Clayton A., Gurney M., Shantikumar S. and Angelini G. (2016). Coronary Artery-Bypass-Graft Surgery Increases the Plasma Concentration of Exosomes Carrying a Cargo of Cardiac MicroRNAs: An Example of Exosome Trafficking Out of the Human Heart with Potential for Cardiac Biomarker Discovery. PLoS One,29;11(4):e0154274.
Mass Spectrometry:
Menezes-Neto A., Fidalgo Sáez MJ., Lozano-Ramos I., Segui-Barber J., Martin-Jaular L., Estanyol Ullate JM., Fernandez-Becerra C., Borrás FE., and del Portillo HA. (2015). Size-exclusion chromatography as a stand-alone methodology identifies novel markers in mass spectrometry analyses of plasma-derived vesicles from healthy individuals. Journal of Extracellular Vesicles; 4: 4: 27378.
Functional study:
Sheller-Miller S, Trivedi J, Yellon SM, and Menon R. (2019). Exosomes Cause Preterm Birth in Mice: Evidence for Paracrine Signaling in Pregnancy. Scientific Reports,24;9(1):608.
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